Si chiama sito di restrizione la specifica sequenza di desossiribonucleotidi riconosciuta da un enzima di restrizione.

I siti di restrizione sono sequenze palindromiche (cioè simmetriche) della lunghezza di 4-6 coppie di basi azotate.

A seconda della sequenza delle basi presenti in un sito di restrizione, l'enzima specifico per il sito taglia entrambi i filamenti della doppia elica producendo un filamento con terminazioni piatte, oppure con terminazioni sfalsate che possiedono sequenze complementari (estremità appiccicose).