Microscopia elettronica: tecniche di osservazione

Il microscopio elettronico a trasmissione permette di osservare preparati sottilissimi, per cui una stessa cellula può essere analizzata "a fettine" ottenendo immagini in sezione. Per ricostruire le strutture reali tridimensionali occorre fotografare diverse sezioni e rielaborarle al computer. Nella maggior parte dei casi però gli organuli sono identificabili anche con una sola immagine. Il potere di risoluzione è così elevato che si possono distinguere anche grosse proteine, come quelle inserite nella membrana cellulare.

Uno stratagemma per ottenere effetti tridimensionali è la tecnica dell’ombreggiatura. Si ricopre il preparato con un sottile strato di metallo vaporizzato, come il platino, che viene spruzzato da un angolo obliquo e si deposita in ragione delle asperità della superficie.

Lo spessore del metallo perciò è più o meno sottile nelle diverse zone, come un manto di neve sul terreno dopo una tormenta. Il risultato finale è un’immagine con aree più scure che appaiono come ombre e aiutano a percepire lo spessore dei diversi oggetti.

La vera tridimensionalità si ottiene con il microscopio elettronico a scansione. In questo caso il preparato viene ricoperto con un velo di metallo, poi un sottile fascio di elettroni scansiona come un pennello tutta la superficie. Un rivelatore misura l’intensità degli elettroni secondari emessi dal campione a seguito della sollecitazione, intensità che varia a seconda del rilievo della superficie scansionata.

Il potere risolutivo è minore rispetto a quello del microscopio elettronico a trasmissione, poiché la radiazione secondaria è costituita da elettroni lenti. Tuttavia le immagini ottenute elaborando il segnale con un computer (con la possibile aggiunta di falsi colori) presentano luci e ombre che danno un’idea molto verosimile delle superfici cellulari.

Una tecnica particolare che ha ottenuto grande successo soprattutto per studiare le membrane cellulari è quella chiamata congelamento-frattura.

Il preparato è congelato a temperatura bassissima in azoto liquido (a –196°C), poi il blocchetto viene fratturato. Il piano di frattura passa normalmente attraverso il doppio strato lipidico che costituisce la membrana cellulare.

Si possono così evidenziare le proteine che attraversano lo strato lipidico, con la tecnica dell’ombreggiatura.

Infine sono interessanti anche le applicazioni in microscopia elettronica della marcatura di anticorpi monoclonali ed enzimi, in questo caso eseguita con particelle di metallo pesante, per esempio oro.

Come avviene nella microscopia in fluorescenza, gli anticorpi o gli enzimi raggiungono il sito della loro azione e la marcatura permette di ritrovarli. Nell’immagine al microscopio elettronico la posizione del composto cercato sarà definita con una grande accuratezza.