Fotometria

Se le caratteristiche spettrali della molecola da esaminare sono già conosciute, cioè se se ne conosce lo spettro di assorbimento, si può regolare l’emissione dell’apparecchio sulla lunghezza d’onda che presenta il maggiore assorbimento. L’apparecchio lavora così in luce monocromatica, cioè di un solo colore.

Ogni molecola in soluzione assorbe una frazione dell’energia associata al fascio di luce; perciò quanto maggiore è la quantità di molecole nel volume della provetta, tanto minore sarà l’intensità della luce che arriva al rivelatore (la si misura in unità di densità ottica, OD). Questo metodo di indagine si chiama fotometrìa.

Per misurare la concentrazione di una sostanza in soluzione si deve determinare preventivamente la curva di taratura, un grafico che mostra la percentuale di luce trasmessa al rivelatore in funzione della concentrazione della molecola. La curva di taratura si ottiene eseguendo le indagini fotometriche su una serie di campioni di cui è nota la concentrazione.

Le principali applicazioni della fotometria sono due:

Misura della concentrazione di molecole di DNA in soluzione

La molecola di DNA assorbe la luce nell’intervallo di lunghezze d’onda corrispondenti all’ultravioletto. Il massimo assorbimento si verifica a 254 nm ed è questa la lunghezza d’onda che viene utilizzata per misurarne la concentrazione al fotometro.

In questo caso non è necessario determinare ogni volta la curva di taratura, in quanto si è misurato che un assorbimento pari a 1 OD corrisponde a una concentrazione di DNA pari a 50 microgrammi/millilitro.

È possibile quindi risalire alla concentrazione del DNA che si vuole misurare applicando una semplice proporzione:

concentrazione incognita (µg/ml) = OD misurato x 50.

Controllo della progressione di una reazione chimica

Una reazione chimica avviene se uno o più reagenti si trasformano in uno o più prodotti. Impostando la lunghezza d’onda idonea per seguire uno dei reagenti o dei prodotti, si eseguono misurazioni della sua concentrazione a intervalli di tempo determinati.

Se la reazione si sta effettivamente svolgendo, sono possibili due casi: se la molecola scelta come indicatore è un reagente, la sua concentrazione diminuirà; se invece essa è un prodotto, la sua concentrazione aumenterà.

L’indagine fotometrica risulta particolarmente utile per seguire l’attività degli enzimi, che modificano complicate molecole organiche.