Descrizione della reazione

Con l’ausilio di micropipettatori allestiamo una reazione di PCR in un volume finale di 50-100 microlitri, contenente i seguenti reagenti:

• DNA che si vuole amplificare, e che fungerà da stampo;
• un gran numero di copie dei due oligonucleotidi sintetici complementari alle estremità del frammento da amplificare;
• desossiribonucletidi, cioè i "mattoni" di cui è costituito il DNA;
• l’enzima Taq Polimerasi;
• soluzione salina tamponata, contenente ioni K⁺ e ioni Mg⁺⁺, per il funzionamento dell’enzima.

Ecco poi come procede, per cicli termici ripetuti, la reazione a catena della polimerasi:

1) i due filamenti della doppia elica della regione di DNA da amplificare vengono separati tramite un ciclo di denaturazione in cui la temperatura di reazione viene portata a 94-95 °C;

2) la temperatura della reazione viene abbassata intorno ai 60°C per permettere l’appaiamento degli oligonucleotidi con le rispettive sequenze complementari presenti sui filamenti di DNA denaturati;

3) la temperatura della reazione viene portata a 72°C per permettere la sintesi del DNA da parte della Taq Polimerasi: a questo stadio da una singola molecola se ne sono originate due;

A questo punto il DNA viene nuovamente sottoposto a denaturazione, con appaiamento dei rispettivi oligonucleotidi e sintesi di quattro nuove catene.

L’intero ciclo di denaturazione-appaiamento-sintesi viene ripetuto da 25 a 40 volte con l’ausilio del cosiddetto Thermal Cycler, uno strumento molto semplice costituito da un blocco metallico a temperatura variabile in cui sono inserite le provette contenenti i reagenti.

In questo modo, se si parte per esempio da 2 molecole di DNA, si ottengono 2ⁿ molecole del frammento di DNA amplificato, dove n è il numero di cicli eseguiti.

La temperatura del blocco metallico può essere variata molto rapidamente, quindi la reazione termina in tempi brevi, mediamente intorno alle due ore.

Schema della PCR

Applicazioni della PCR