Come si procede in pratica?

Una miscela di molecole di DNA a doppia elica o di RNA a singola elica, separate tramite elettroforesi, viene trasferita su filtro di nitrocellulosa o nylon, che ha le caratteristiche della carta assorbente ed è caricato positivamente così da trattenere le molecole di acido nucleico cariche negativamente.

Si mette il filtro a contatto con la lastra di gel; sotto il gel si pone un foglio di carta porosa con i bordi immersi in soluzione tamponata. Questa soluzione imbeve per capillarità il gel e il filtro di nitrocellulosa o nylon, trascinando anche le molecole di DNA o RNA, che così si fissano sul filtro nella stessa posizione che occupavano sul gel.

Nel caso del Southern blotting il DNA sul gel è a doppio filamento, perciò le molecole di DNA devono essere denaturate dopo la separazione con l’elettroforesi, tramite esposizione del gel a una soluzione alcalina.

Nel caso del Northern blotting le molecole di RNA, già a singola elica, sono comunque mantenute in uno stato totalmente denaturato all’interno del gel grazie alla presenza di formaldeide, un potente agente denaturante.

Il filtro viene esposto a una sospensione contenente la sonda marcata per un periodo di tempo abbastanza lungo (16-20 ore) e in condizioni di reazione che favoriscono l’ibridazione.

Il successivo lavaggio permette che risultino marcate soltanto le molecole di DNA o RNA (sul filtro) complementari alla sonda utilizzata.

Queste ultime vengono rivelate tramite autoradiografia.