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Come
si procede per eseguire un semplice clonaggio?
Per poter
essere utilizzati come vettori di clonaggio, i plasmidi
circolari purificati vengono tagliati con una nucleasi
di restrizione in modo da essere linearizzati.
Il frammento
di DNA che deve essere inserito nel vettore viene tagliato con
la stessa nucleasi di restrizione e quindi aggiunto al DNA plasmidico
linearizzato.
 Le
estremità complemenatri (estremità coesive)
che si sono generate tramite taglio con la stessa nucleasi di
restrizione possono appaiarsi tra loro e formare una molecola
circolare ricombinante,
oppure rigenerare il vettore di clonaggio stesso.
Il
legame covalente fra le due molecole è ristabilito grazie
all段ntervento di un enzima, la DNA
ligasi, che utilizza ATP
per ricreare il legame ribosio-fosfato tra le due molecole. Questa
prima fase del clonaggio
avviene in provetta e genera il plasmide ricombinante.
 Il
plasmide ricombinante viene introdotto in cellule batteriche
la cui membrana
è stata resa permeabile al DNA. La permeabilità
è temporanea e si ottiene trattando le cellule con fosfato
di calcio (CaPO4) oppure sottoponendole a un breve
impulso di corrente elettrica. Dopo l段ncorporazione all段nterno
della cellula batterica il plasmide ricombinante si replica, riproducendosi
in un enorme numero di copie con l段nserto di DNA esogeno.
Per
selezionare le cellule che hanno incorporato il plasmide (le cosiddette
cellule trasformate) i batteri vengono messi in coltura
su una piastra su terreno contenente un antibiotico,
generalmente ampicillina.
Si
scelgono sempre, infatti, vettori di clonaggio che portano il
gene
per la resistenza a un antibiotico e soltanto le cellule che contengono
il plasmide possono sopravvivere in presenza di quell誕ntibiotico.
Queste ultime si divideranno, per dar luogo nel giro di poche
ore a una colonia visibile ad occhio nudo.
Una
volta identificate le colonie che contengono il plasmide, è
necessario identificare tra queste le colonie in cui è
presente il plasmide con l段nserto.
Si
estrae perciò il DNA plasmidico da un certo numero di colonie
e lo si analizza per la presenza o assenza dell段nserto con nucleasi
di restrizione oppure tramite PCR.
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