Cromatografia su colonna

Questa tecnica è usata in un laboratorio di biologia cellulare principalmente per separare quantità significative di proteine.

Si usa un contenitore cilindrico di vetro o plastica, chiamato colonna, riempito di granelli di una matrice solida e permeabile, per esempio cellulosa, immersa in un solvente.

In cima a questa colonna si versa la soluzione con le proteine e poi si continua ad "annaffiare" con grandi quantità di solvente. Il solvente che scende trascina le proteine verso il basso: le diverse proteine vengono ritardate in modo diverso a seconda della loro interazione con la matrice e vengono quindi raccolte separatamente in provette numerate, all’uscita sul fondo della colonna.

A seconda della matrice scelta le proteine possono essere separate in base alla loro carica (la cosiddetta cromatografia a scambio ionico, in cui la matrice è carica positivamente o negativamente e lega molecole con carica opposta), in base alle loro caratteristiche di idrofobicità (cromatografia idrofobica, in cui i granelli che costituiscono la matrice espongono delle catene idrofobe), oppure in base alle loro dimensioni (cromatografia su gel).

CROMATOGRAFIA SU GEL

In questo particolare tipo di cromatografia su colonna la matrice è costituita da un polisaccaride, agarosio o destrano, le cui molecole si intrecciano a formare delle matasse attraverso le quali viene fatta passare la soluzione contenente le proteine da separare.

Il principio su cui si basa la separazione è il seguente: le proteine più piccole resteranno imbrigliate tra le molecole aggrovigliate del polisaccaride, mentre quelle più grandi passeranno negli interstizi tra un granulo e l'altro e scenderanno più velocemente.

Dopo il passaggio sulla colonna, il liquido è recuperato in una serie di provette. Queste verranno riempite in successione da proteine di grandezza decrescente. In questo modo, quindi, le proteine sono separate sulla base della dimensione.

Esistono diverse matrici, in cui la dimensione degli interstizi fra un granulo e l’altro è differente, che servono per separare molecole in diversi ambiti di pesi molecolari.

La cromatografia su colonna non produce frazioni altamente purificate, quando si parte da miscele complesse di proteine: un singolo passaggio attraverso una colonna di solito arricchisce la sospensione di una certa proteina non più di venti volte.

Poiché molte proteine sono poco rappresentate in un estratto cellulare, spesso è necessario utilizzare differenti tipi di colonne in successione per ottenere un grado di purezza sufficiente.

CROMATOGRAFIA PER AFFINITÀ

Una procedura sicuramente più efficiente della cromatografia su colonna è la cromatografia per affinità. Viene usata sia per proteine che per altre molecole; qui citeremo, come esempio, la purificazione dell'mRNA.

Si è scoperto che, durante la maturazione, all'mRNA destinato al citoplasma viene aggiunta un "coda poliA", cioè formata da adenosin-ribonucleotidi. Questa scoperta suggerisce un modo per purificare l'mRNA, con uno speciale metodo di cromatografia.

Si deve preparare una colonna cromatografica (con granuli di polipropilene o cellulosa). Si prepara una soluzione di poliT, cioè oligonucleotidi di timina, e la si trasferisce sulla colonna: le code poliT stabiliscono legami forti con i granuli della colonna. Si lava la colonna con acqua per eliminare i poliT non legati.

L'estrazione chimica dell'RNA da una cellula è simile a quella del DNA. Si disperde l'RNA in acqua e lo si scalda a 65°C per 5 minuti, per evitare ripiegamenti della catena che possano celare la coda poliA; si passa sulla colonna (meglio se due volte).

Gli mRNA, che portano la coda poliA, resteranno debolmente attaccati alla colonna, perché complementari alle code poliT (per questo si parla di affinità). Gli RNA di tipo diverso, i t-RNA e gli r-RNA, scenderanno al fondo della colonna insieme al solvente.

Ora si deve prelevare l'mRNA rimasto attaccato alla colonna. La soluzione di lavaggio contiene detergenti che rompono solo i legami deboli e non i legami covalenti forti.

Se si vuole un elevato grado di purezza bisogna cambiare la colonna e ripetere la cromatografia per affinità sull'mRNA già purificato una volta.

La cromatografia per affinità si applica anche alle proteine: in questo caso è basata sulle interazioni fra la proteina che ci interessa separare e un'altra proteina, per esempio un anticorpo specifico, o un acido nucleico immobilizzato sulla matrice inerte.

Cromatografia su carta