Come
si prepara un gel d'agarosio?
L’agarosio
è un polisaccaride presente in natura nelle alghe.
Sciogliamo,
tramite ebollizione, una quantità di agarosio tale da ottenere
un gel alla concentrazione desiderata (tra 0.8% e 2%). Versiamolo
in una vaschetta in cui è stato precedentemente appoggiato
un "pettine" per formare i pozzetti, piccoli
buchi.
Una
volta che il gel si è solidificato lo si depone in un'apposita
vasca e lo si copre con una soluzione
tamponata.
A questo punto i campioni contenenti una soluzione di DNA
e glicerolo
vengono deposti nei pozzetti e si applica un campo elettrico:
il DNA migra verso il polo positivo con una velocità inversamente
proporzionale alla lunghezza della molecola.
Dopo
la corsa elettroforetica il DNA non è visibile nel gel,
a meno che non venga marcato o colorato. Il metodo più
comunemente usato per visualizzare il
DNA consiste nell'esporlo a una soluzione di etidio bromuro,
un’agente intercalante in grado di insinuarsi tra una base e l’altra
della doppia elica del DNA, che è fluorescente se esposto
alla luce ultravioletta.
Con
l’elettroforesi su gel d'agarosio, variando la concentrazione
del gel, è possibile separare molecole di DNA di lunghezza
che va da oltre 15 000 paia di basi a meno di 100 paia di basi.
Non è possibile, però, distinguere tra loro due
molecole che hanno quasi la stessa lunghezza (per esempio una
di 8800 e una di 9000 paia di basi).
Una
variante dell'elettroforesi in gel d'agarosio, detta elettroforesi
in campo pulsante, rende possibile separare molecole di DNA
estremamente lunghe (fino a 2.5 milioni di paia di basi).
In
questo tipo di elettroforesi la polarità del campo elettrico
varia periodicamente, costringendo la molecola di DNA a ri-orientarsi
ogni volta per continuare a muoversi nel gel.
Poiché
le molecole di grosse dimensioni impiegano più tempo per
ri-orientarsi, le molecole si muoveranno tanto più lentamente
quanto più sono lunghe, separandosi così distintamente
fra loro.
Separazione
di proteine (SDS-PAGE)
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