Lettura della sequenza

I frammenti generati con metodo chimico o enzimatico sono separati per elettroforesi su un gel di poliacrilamide denaturante e rivelati tramite autoradiografia.

I frammenti, che sono marcati radioattivamente, compaiono sulla lastra autoradiografica e la loro posizione finale rivela la loro dimensione, cioè la distanza fra l’inizio della sequenza e la base azotata in corrispondenza della quale la molecola di DNA è stata rotta (metodo chimico) o interrotta (metodo enzimatico).

Statisticamente è probabile che in ogni provetta il DNA sia stato rotto, o interrotto, in tutte le posizioni possibili, così che sul gel compariranno numerose bande corrispondenti a frammenti di lunghezza crescente. Il confronto fra le quattro reazioni indipendenti, separate in parallelo sullo stesso gel, permette la ricostruzione della sequenza nucleotidica.

Come possiamo leggere la sequenza delle basi?

Prendiamo l'esempio della provetta i cui frammenti di DNA sono tutti interrotti in corrispondenza di una adenina, e supponiamo che il DNA originale fosse questo:

ACGCTACAGCATCGTCAGCTGCCACTGGTACCGTCGAATTACCAGAT

Nella provetta ci saranno frammenti di diversa lunghezza:

05-TGCGA

12-TGCGATGTCGTA

20-TGCGATGTCGTAGCAGTCGA

26-TGCGATGTCGTAGCAGTCGACGGTGA

29-TGCGATGTCGTAGCAGTCGACGGTGACCA

33-TGCGATGTCGTAGCAGTCGACGGTGACCAGGCA

38-TGCGATGTCGTAGCAGTCGACGGTGACCAGGCAGCTTA

39-TGCGATGTCGTAGCAGTCGACGGTGACCAGGCAGCTTAA

46-TGCGATGTCGTAGCAGTCGACGGTGACCAGGCAGCTTAATGGTCTA

Dal pozzetto il DNA è migrato e il frammento più corto, quello di 5 basi (05), si troverà quasi in fondo al gel. Lo segue un frammento (12) poco più in alto.

Le bande corrispondenti ai frammenti di 38 e 39 nucleotidi saranno molto vicine, a indicare che ci sono due A vicine, e così via. Lo stesso discorso vale per le altre basi azotate nei tre pozzetti paralleli.

Se i 4 pozzetti sono stati ritagliati con cura, in modo che i materiali in partenza fossero tutti sulla stessa linea, la lettura del codice di basi azotate è molto facile. Basta far scorrere sul gel dal basso verso l'alto una riga di riferimento: a ogni passo la riga incontra una banda in una delle quattro colonne A, T, C, G, così che, dal basso verso l'alto, potremo leggere l’intera sequenza.

Sequenziamento automatico