Sequenziamento automatico

Nel caso del sequenziamento automatico il principio è quello del metodo enzimatico, ma la reazione viene eseguita in un unico tubo che contiene, oltre al frammento di DNA che si vuole sequenziare: l’enzima DNA polimerasi; l’oligonucleotide sintetico che serve come punto d’appoggio per la DNA polimerasi; i quattro nucleotidi; e i ddNTP, marcati ciascuno con un composto fluorescente differente.

All’interno del sequenziatore automatico la reazione passa attraverso un capillare che contiene una matrice con la stessa funzione di separazione dei frammenti normalmente svolta dal gel di poliacrilamide.

In questo caso la separazione è simile a quella della cromatografia su colonna: i frammenti di diverse dimensioni si separano e sono rivelati, uno dopo l’altro, da luce laser di lunghezza d’onda tale da eccitare la fluorescenza dei ddNTP.

Le misure del rivelatore permettono di riconoscere i diversi picchi di fluorescenza, ciascuno con emissione a una determinata lunghezza d’onda, generati dai quattro diversi ddNTPs. In questo modo la sequenza nucleotidica del frammento di interesse ìpuò essere ricostruita da un computer.I sequenziatori automatici possono lavorare su frammenti di 200-1000 nucleotidi. Il sequenziamento di un frammento di DNA con 500 basi azotate dura poco più di mezz’ora.

Metodo chimico ed enzimatico