Metodo chimico

Il substrato per il sequenziamento di tipo chimico consiste di un frammento di DNA purificato, ottenuto tramite digestione con specifiche nucleasi di restrizione o tramite una reazione di PCR.

Il frammento, presente in numerose copie, viene marcato alle estremità 5’ utilizzando un enzima che si chiama T4 polinucleotide chinasi.

Questo enzima scambia il gruppo fosfato libero posizionato all’estremità 5’ della molecola di DNA con un altro gruppo fosfato, proveniente da una molecola di ATP e marcato con fosforo radioattivo (³²P).

Quattro campioni indipendenti di questo DNA vengono esposti a un trattamento chimico blando, diverso per ogni provetta, che distrugge selettivamente il legame fra desossiribosio e fosfato in corrispondenza, rispettivamente, di una delle quattro basi azotate.

Poiché il trattamento è blando, mediamente viene tagliato soltanto un legame in ciascuna molecola di DNA, generando nella stessa provetta una serie di frammenti di lunghezza diversa.

Metodo enzimatico

Nel sequenziamento con il metodo enzimatico, il frammento di DNA che si vuole sequenziare è utilizzato come stampo per la sintesi di DNA in vitro, tramite l’enzima chiamato DNA polimerasi.

Il DNA viene sintetizzato a partire da uno stesso punto, utilizzando cioè lo stesso oligonucleotide sintetico come punto di partenza per la DNA polimerasi, ed è marcato tramite l’incorporazione di un deossiribonucleotide radioattivo (marcato con ³⁵S o ³³P).

La chiave del metodo enzimatico consiste nell’utilizzo di nucleotidi modificati, i dideossiribonucleotidi trifosfati (ddNTPs), che sono nucleotidi il cui zucchero è privo del gruppo ossidrile in posizione 3’.

Questi nucleotidi, pur essendo incorporati regolarmente nella nuova molecola di DNA, bloccano la crescita ulteriore della catena perché sono sprovvisti del punto di aggancio.

La sintesi di DNA si fa procedere in quattro provette indipendenti, in ciascuna delle quali è aggiunta una piccola quantità di ddNTP che porta una delle quattro basi azotate.

Le nuove molecole di DNA sintetizzate si interrompono quando il ddNTP viene incorporato. In ogni provetta ciò avverrà in corrispondenza di una diversa base azotata: avremo quindi quattro serie di frammenti di lunghezze diverse.

Lettura della sequenza

Sequenziamento automatico