La trascrizione in vitro

La trascrizione e la traduzione sono processi cellulari estremamente complessi, perché richiedono il concorso di numerosi enzimi. Il loro funzionamento non può pertanto essere riprodotto in vitro semplicemente aggiungendo i singoli componenti necessari alla reazione.

È possibile invece far avvenire queste reazioni in estratti cellulari che (seppure in maniera disorganizzata) contengono tutti i componenti necessari, tranne lo specifico segmento di DNA che si vuole trascrivere o l'RNA messaggero che si vuole tradurre: questi devono essere introdotti dall'esterno.

Per effettuare una trascrizione in vitro, per esempio, si deve allestire in una provetta una reazione contenente l'estratto nucleare, il DNA stampo da trascrivere, quantità uguali dei quattro ribonucleotidi (A, U, C, G), la creatina fosfato e la fosfochinasi, che forniscono l'energia per alimentare la reazione.

Uno dei quattro nucleotidi (di solito U) è marcato con fosforo radioattivo, ³²P. Tutto l'RNA sintetizzato in questo modo sarà marcato radioattivamente e perciò sarà facilmente riconoscibile.

Si lascia incubare a 30°C per un'ora o due. Alla fine dell'incubazione si presume che l'RNA di nostro interesse sia stato trascritto.

Si blocca la reazione aggiungendo sostanze che denaturano le proteine, come l'urea o l'SDS. Ora si deve procedere all'estrazione dell'RNA che, una volta purificato, può essere caricato su gel.

Con questa procedura, da un frammento di DNA contenente un gene interessante si può ottenere l'RNA messaggero corrispondente, utile per ulteriori studi.

La duplicazione del DNA in vitro

La traduzione in vitro