Il Western blotting

Il Western blotting, o immunoblotting, permette di localizzare una proteina all’interno di una miscela separata tramite elettroforesi.

Le proteine totali estratte dalle cellule vengono separate tramite elettroforesi e trasferite su un filtro di nitrocellulosa. Il filtro viene incubato con un anticorpo, detto primario, che riconosce specificamente la proteina che interessa studiare. Il sito di legame dell’anticorpo primario sul filtro viene rivelato tramite un anticorpo secondario, praticamente un anti-anticorpo che si lega all’anticorpo primario, coniugato (cioè legato) a un enzima.

L’enzima può essere a sua volta facilmente visualizzato, come una colorazione del filtro, grazie alla reazione che sviluppa in presenza di un opportuno substrato.

Uno degli enzimi più comunemente utilizzati per rivelare il legame di un anticorpo alla proteina specifica è la perossidasi. Questo enzima reagisce in presenza di perossido d’idrogeno (l’acqua ossigenata) e catalizza l’ossidazione del luminolo. Il luminolo ossidato si trova in uno stato eccitato che decade emettendo fotoni, i quali andranno a impressionare una lastra autoradiografica. Sovrapponendo la lastra al filtro di nitrocellulosa si avrà una traccia scura nel luogo in cui si trova la proteina

ELISA

Reazioni di immunoprecipitazione