L’ibridazione in situ

La sonda marcata può essere ibridata a interi cromosomi, il cui DNA è stato denaturato in seguito a rapida esposizione a pH molto alcalini.

Questa tecnica, nota come ibridazione in situ, è stata largamente utilizzata per stabilire la posizione dei geni sui cromosomi, la cosiddetta mappatura genica.

Inoltre essa permette di identificare eventuali cambiamenti strutturali che possono essere avvenuti nei cromosomi. Quest’ultima applicazione è sfruttata nello studio delle malattie genetiche e ha lo scopo di identificare soprattutto delezioni, ma anche inserzioni e traslocazioni (cioè cambiamenti di posizione di un segmento cromosomico) in individui portatori di patologie ereditarie a carico di uno specifico locus cromosomico.

Dal punto di vista metodologico si procede come per eseguire un cariotipo, procedendo alla reazione di ibridazione una volta che i cromosomi delle cellule in metafase sono stati fissati sul vetrino.

L’ibridazione in situ può essere utilizzata anche per visualizzare una molecola di RNA all’interno di una cellula, allo scopo di identificare le cellule di un tessuto nelle quali vi è trascrizione di un certo gene.

L’incubazione con la sonda va eseguita su cellule fissate su vetrini, avendo l’accortezza di immergerle prima in una soluzione acida, per degradare parzialmente le proteine cellulari (specialmente quelle più intricate del citoscheletro) e rendere l’RNA cellulare più accessibile all’ibridazione. Dopo il lavaggio per eliminare le sonde non ibridate, si procede alla colorazione e all’osservazione al microscopio ottico.

Originariamente queste tecniche utilizzavano sonde altamente radioattive che venivano rivelate tramite autoradiografia.

Un grande miglioramento nel potere di risoluzione spaziale di questa tecnica è stato ottenuto tramite l’utilizzo di sonde non radioattive, marcate con gruppi chimici e rivelate tramite anticorpi fluorescenti, che permettono di localizzare con più precisione la posizione della sequenza all’interno del cromosoma o nell’RNA specifico all’interno della cellula.

Questa innovazione tecnica va sotto il nome di FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). 

L’ibridazione a stringenza ridotta

Southern e Northern blotting