Come
ottenere un estratto cellulare
Per
ottenere un estratto cellulare occorre prima di tutto provocare
una disgregazione (lisi) delle cellule.
Esse
vengono sospese in una soluzione ipotonica,
a basso contenuto salino, e agitate con vigore. Di solito questo
processo risparmia i nuclei,
che hanno una struttura più compatta e perciò
più resistente; questi ultimi vengono recuperati tramite
una normale centrifugazione sotto forma di pellet.
Per
rompere il nucleo ed estrarre gli enzimi
della trascrizione
si devono aggiungere reagenti forti, come il solfato di ammonio
ad alta concentrazione, che ha il duplice scopo di rompere la
membrana nucleare e indurre contemporaneamente la precipitazione
del DNA.
Dopo
l'aggiunta di questi reagenti e una breve incubazione si procede
a un'ultracentrifugazione:
la maggior parte delle proteine
resta in soluzione, mentre il DNA e tutto il restante materiale
di scarto
precipitano sul fondo.
La
duplicazione del DNA in vitro
La
trascrizione in vitro
La
traduzione in vitro
