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Come si
genera una molecola di DNA radioattiva?
Una molecola
di DNA marcata con un isotopo radioattivo prende il nome di sonda.
Il modo più
semplice per ottenere una sonda radioattiva è allestire
una reazione di polimerizzazione in
vitro.
Il DNA che
si vuole marcare viene dapprima denaturato tramite ebollizione
e infine incubato a 37°C in una soluzione salina tamponata contenente:
- i quattro
deossiribonucleotidi, di
cui uno marcato con un isotopo radioattivo (generalmente fosforo,
32P);
- un enzima
che promuove la sintesi del DNA (DNA
polimerasi);
- una miscela
di oligonucleotidi, lunghi
6-9 basi e a sequenza non definita, che si appaiano in maniera
casuale lungo la molecola di DNA denaturata e servono da appoggio
per la sintesi del DNA da parte della DNA polimerasi.
È
possibile, secondo lo stesso principio e con modalità simili,
generare in vitro una molecola di RNA radioattiva: in questo
caso l’enzima utilizzato sarà una RNA
polimerasi e i deossiribonucleotidi saranno sostituiti da
ribonucleotidi.
In
alternativa alla marcatura con isotopi radioattivi, si può
marcare la sonda tramite l’incorporazione di un nucleotide modificato,
contenente cioè una catena laterale (per esempio biotina
o digoxigenina) che viene a sua volta riconosciuta da un anticorpo
specifico, coniugato a un composto fluorescente.
L’ibridazione
in situ
L’ibridazione
a stringenza ridotta
Southern
e Northern blotting
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